Сергей Никифорович Василенко родился 30 (18) марта 1872 года в деревне Царёвка (ныне Долгоруковский район Липецкой области) в семье управляющего имениями.Учился в гимназии-пансионе Креймана. Обучаться музыке начал с 1888 года у Ричарда Ноха, затем у Александра Гречанинова, Георгия Конюса и Сергея Протопопова.
В 1891 году по желанию отца поступил на юридический факультет Московского университета, но в 1895 году оставил университет и поступил в Московскую консерваторию.
В мае 1901 года он её окончил с золотой медалью (по классам контрапункта и фуги у Сергея Танеева, композиции у Михаила Ипполитова-Иванова и дирижирования у Василия Сафонова).
В 1903-1905 годах был дирижёром Московской частной оперы Мамонтова, в 1907 организовал цикл общедоступных «Исторических концертов» и в течение десяти лет дирижировал ими.
В том же 1907 году получил место профессора оркестровки и композиции в Московской консерватории, работал на этой должности до самой смерти.
Василенко - автор опер (6), балетов (6), оркестровых, инструментальных и вокальных произведений.
Народный артист РСФСР (1940) и Узбекской ССР (1939).
Умер 11 марта 1956 года, похоронен на Введенском кладбище в Москве.